ما هو فحص الــPCR

ما هو فحص ال PCR

مع تقدم الطب والعلوم، تشهد التحاليل الطبية موجةً من التقدم والإبداع، ومعظم الأمراض في الوقت الحالي تتواجد لها اختبارات نوعية أو على الأقل موجهة تساعد في تأكيد تشخيص الإصابة بها، وفي ظل انتشار وباء الكورونا المستجد حاليًا بات العالم كلُّه يتحدث حول فحص الPCR أو ما يُعرَف بتفاعل سلسلة البوليميراز، وعن مدى قدرته على تشخيص المرض، ويعتمد هذا الفحص بشكل أساسي على التركيز على  الجينوم وDNA العامل البكتيري أو الفيروسي، حيث يعمل على تضخيم جزء صغير من شريط DNA، وتكوين آلاف النسخ منه، كما تم استخدامه في التحقيقات والجرائم، ويحتاج هذا الاختبار لتوافر بعض الشروط كوجود درجة حرارة تتغير بحسب مرحلة الاختبار، ويتميز هذا الفحص بكونه يُمثِّل سلسلةً من العمليات البيولوجية الدقيقة، مما يعني وجود دقة عالية مرتبطة به، ولكن لا يخلو الأمر من وجود مشاكل في الاختبار، وفي هذا المقال سيتم تناول جميع الأمور المتعلقة بهذا الفحص، من فوائد وميزات وصولًا للسلبيات المرتبطة به.^[١]

اكتشاف فحص ال PCR

يُعد هذا الاكتشاف إنجازًا كبيرًا في مجال الطب التشخيصي، فلقد ساعد اكتشاف اختبار تفاعل سلسلة البوليميراز في تطوير علم الأحياء الجزيئي، كما حقق تقدمًا كبيرًا في مجالات الطب الشرعي، والتشخيص الطبي وعلم الأحياء التطوري، وذلك بسبب تمكُّن العلماء من تضخيم قطعة صغيرة منالحمض النووي البشري، وتحويلها لقطعة كبيرة تُجرَى عليها تجارب عدة، وقد تم تطوير هذا الفحص في عام 1983 من قِبَل عالم الكيمياء الحيوية كاري موليس، وقد نال جائزة نوبل على اكتشافه هذا بعد عشر سنوات تقريبًا، وقد غيَّر هذا الاكتشاف من نظرة الطب تجاه العديد من الأمور، إذ كانت اختبارات تضخيم الحمض النووي قبل اكتشافه تحتاج وقتًا طويلًا، وعددًا كبيرًا من العمال، وفي هذا الوقت يستطيع جهاز تفاعل سلسلة البوليميراز تكرار العديد من نسخ الحمض النووي في غضون عدّة ساعات، وذلك من خلال ثلاث مراحل وضمن شروط معينة.^[٢]

خطوات فحص ال PCR

يحتاج هذا الفحص لتوافر خمسة مكونات أساسية حتى يكتمل العمل، وهي قالب الحمض النووي المراد نسخه، والبادئات، والتي تُشكِّل امتدادات قصيرة من DNA، وسمّيت بالبادئة لأنها تتواجد في بداية اختبار تفاعل سلسلة البوليميراز، وتعمل هذه البادئة على ربط جزئي الحمض النووي المراد نسخهما مع بعضهما، ويكون هناك حاجة لقواعد الحمض النووي التايمين والغوانين، والسيتوزين، والأدينين، والتي تقوم بتشكيل حبل جديد من DNA، ويتم إضافة هذه القواعد من خلال تفعيل إنزيم البلمرة، كما يكون هناك حاجة لتوافر عازل يُؤمِّن بيئةً مناسبةً حاضنةً للتفاعل، وفيما يأتي تفصيل أكبر حول هذه المراحل وما يحدث فيها:^[١]

• مرحلة الإفساد: يتم خلال هذه المرحلة تسخين الDNA والمكونات الأساسية على حرارة 95 درجة مئوية، إذ تتسبب هذه الحرارة بتفكيك الروابط الهيدروجينية بين شريطي DNA وبالتالي فصلهما، وسيعمل كل من هذان الشريطان كقالب لإنتاج خيوط جديدة من الDNA، وتستغرق هذا المرحلة ما بين 15-30 ثانية.
• مرحلة التلدين: يحدث في هذه المرحلة انخفاض في درجة الحرارة حتى الدرجة 65، مما يجعل البادئة قادرة على الارتباط بقالب الDNA، ويتم من خلالها إضافة القواعد وربطها مع بعضها عبر روابط هيدروجينية، والتي تربط ما بين كل أساس مع ما يناسبه من الجهة المقابلة، ويتم بناء خيط DNA الجديد عبر القالبان باتجاهين متعاكسين، مما يعني وجود بادئتين باتجاهين متعاكسين، وتستغرق هذه المرحلة حوالي 30 ثانية.
• مرحلة التمديد: تعود الحرارة وترتفع إلى الدرجة 72 درجة مئوية وذلك لصنع إنزيم Taq DNA polymerase،حيث يُؤخَذ هذا الإنزيم من بكتيريا محبة للحرارة، وبالتالي يكون قادرًا على تحمل درجات حرارة عالية، ويُساعد هذا الإنزيم على تشكيل الخيط الجديد من الDNA وربطه مع الخيط الأساسي، وبالتالي تكوين جزيء مزدوج من الDNA، وتختلف مدة هذه المرحلة بحسب طول الشريط المطلوب نسخه، ولكنّها تستغرق دقيقةً واحدةً في أغلب الأحيان.

ما هي استخدامات فحص ال PCR

يُعد هذا الفحص من الفحوص الحساسة جدًا، والتي يحتاج القائمون عليها لأن يكونوا حذرين جدًا تجنبًا لحدوث تلوّث في العينة، مما قد يؤدي لوجود نتائج مضلّلة، ولعلّ تقنية تفاعل سلسلة البوليميراز استُخدِمَت في أمور لا تُعد ولا تُحصى، منذ اكتشافها وحتى هذه اللحظة، ولعلّ اكتشاف الأمراض الوراثية كالتليف الكيسي كان من أهم استخدامات هذا الفحص، ويمكن ذكر بعض الأمور الأخرى التي تم استخدام هذا الفحص فيها وفق ما يأتي:^[٣]

• تشخيص الأمراض: بفضل هذا الاختبار وبفضل تضخيم سلسلة DNA، يتمكّن الأطباء من تشخيص بعض الأمراض، كالسرطان وداء لايم، من خلال الكشف عن العامل المسبب،^[٢] وقد كان هذا الفحص دقيقًا جدًا في تأكيد الإصابة بعدة أمراض بكتيرية وفيروسية من أهمها مرض عوز المناعة المكتسبة والذي تم اكتشافه في وقت مبكر حتى قبل تشكيل الأجسام المضادة من قبل الخلايا المناعية، أي بعد حوالي عدة أيام فقط من الإصابة^[٤]، كما كان هذا الفحص مفيدًا جدًا في تشخيص الإصابة بالسل، والذي ترافق وجوده مع مرض نقص المناعة المكتسبة في الآونة الأخيرة، كما ساعد هذا الاختبار في كشف المقاومة على أدوية السل، مما يعني وجود إصابة بنوع جديد من المتفطرة مختلفة عن النوع المعروف، كما ساعد في تفريق السل عن الالتهاب الرئوي غير النمطي.^[٥]
• التحاليل الجنائية: يتم الاعتماد على تضخيم جزء من DNA الدم، أوالسائل المنوي وجذور الأشعار، مما يُساعد في كشف الأمور المتعلقة بالجرائم، والتعرف على الأشخاص المفقودين والمجرمين، وقد تم استخدام هذا الفحص في تأكيد الأبوّة عند الأطفال.^[٢]
• مطابقة الأنسجة في حالات التبرع بالأعضاء: من شروط قبول الطُعم وعدم قيام جهاز المناعة برفضه هو وجود تطابق في عدد معين من المورثات بين المُعطي والآخذ، وللتأكد من هذه المورثات يُستخدم فحص الPCR للتأكد من وجود العدد الأدنى من هذه المورثات على الأقل.^[٢]
• إجراء البحوث: لقد ساعد اكتشاف هذا الاختبار في دراسة الكائنات الحية المنقرضة، وكان ذلك بالاعتماد على عينات من العظام التابعة لها.^[٢]

فحص ال RT-PCR

يُدعى بالنسخ العكسي لتفاعل سلسلة البوليميراز، وسُمّي بالعكسي لأنه يعتمد على وجود mRNA، أو ما يدعى بالرنا مرسال كقالب لنسخ وتشكيل متمم من الDNA، ويُدعى هذا الطاق الجديد بالشريط المكمل cDNA، ثم يتم تحويله بالاعتماد على إنزيم DNA polymerase إلى DNA ثنائي الطاق، ويستخدم عندها هذا الDNA في فحص الPCR، ويُستَخدَم فحص RT-PCR في الكشف عن وجود الرنا مرسال في العينة، ولذلك يُستَخدَم بشكل كبير لتشخيص الإصابة بفيروس التهاب الكبد C، والذي يكون حمضه النووي RNA، ويستطيع هذا الاختبار تشخيص الإصابة بالفيروس حتى مع وجود أعداد قليلة منه داخل الجسم، كما يُعد الاختبار الأفضل في الكشف عن وجود عدوى من الأم باتجاه الطفل في فترة ما حول الولادة في ما يخصّ الإصابة بالتهاب الكبد C، كما تم الاعتماد عليه في تأكيد انتقال نوع معين من الكروموسومات المرتبطة بمرض ما من جيل لآخر.^[٦]

فحص ال PCRللكورونا

في الوقت الحالي، يُعد فحص الRT-PCR الفحص الأكثر استخدامًا في تشخيص الإصابة بفيروسالكورونا المستجد، ويتم تطبيق هذا الاختبار على عينة مأخوذة من الطرق التنفسية العلوية أو السفلية عبر مسحة من البلعوم الأنفي، أو بعد الحصول على غُسالة القصبات، ويُجرَى هذا الفحص على المرضى ذوو الخطورة العالية للإصابة بهذا المرض، والذين يملكون تاريخًا بالسفر لمنطقة موبوءة، أو الاتصال مع شخص مصاب، وتشير النتيجة الإيجابية لهذا الفحص إلى وجود إصابة نشطة بالكورونا، ولكن هذا لا يستبعد وجود إصابة فيروسية أو بكتيرية مشاركة لهذا الفيروس، بينما لا يمكن الأخذ بالنتائج السلبية والتي لا تنفي الإصابة بهذا المرض، مما يعني وجود سلبية كاذبة، إذ يجب الجمع بين النتائج المخبرية والأعراض السريرية والمعلومات الوبائية للوصول إلى نتيجة مثالية، كما ومن المهم المحافظة على نظافة العينات والأدوات المُستخدَمة في الفحص، والتي تحتاج لطرق تعقيم خاصة، كما يجب التأكد من تاريخ صلاحية المواد المستخدَمَة في الاختبار، وعدم استخدام مواد تابعة لعدة شركات لضمان الحصول على أفضل النتائج، وتجنب الوقوع في أخطاء التشخيص.^[٧]

مدى دقة فحص ال PCR

في السنوات الأخيرة، وبسبب اللجوء إلى عدة فحوصات لتشخيص أو الكشف عن الإصابة بمرض ما، فإن الهاجس الأكبر لدى العلماء كان حول دقة هذا الفحص، ومقدار اعتمادهم عليه في إعطاء النتائج الحتمية، ولذلك كان فحص الPCR يحتاج عدة دراسات ولسنوات عديدة بعد اكتشافه للتأكد من دقته، ويوجد معيارين لدراسة دقة التحليل، وهما حساسية ونوعية التحليل، وبعد عدة دراسات تم التوصل إلى مجموعة شروط يجب توافرها للوصول إلى أفضل دقة لهذا الاختبار، ويمكن شرحها كالآتي:^[٨]

• يكون اختبار تفاعل سلسلة البوليمراز على درجة عالية من الدقة إذا استطاع إنتاج عدد أكبر من الDNA بأقل عدد ممكن من الدورات، وللوصول إلى هذه النتيجة يجب ضبط درجة الحرارة وشروط العزل بالشكل الأمثل.
• يمكن الحصول على فحص دقيق جدًا إذا ما تم إجراء الاختبار على قطعة صغيرة من الحمض النووي، كما تجب تنقية الحمض النووي المُضَخم من خلال إزالة النطاقات غير المحددة الناتجة عن عملية التضخيم.
• يمكن زيادة دقة هذا الفحص من خلال إضافة بعض المواد التي تجعل من السهل وصول البادئة إلى الموقع المحدد لها، وتشمل هذا المواد الجليسيرول والفورماميد، أو الوصول لدرجة حموضة منخفضة، ولذلك يمكن القول بأنّ مدى دقة هذا الفحص ليست مطلقةً وإنما متوقفة على توافر الشروط المناسبة لهذا الفحص.

إيجابيات فحص ال PCR

تتواجد هذه الإيجابيات في فحص تفاعل سلسلة البوليميراز مهما كان السبب الكامن وراء إجرائه، وربما كان التطور الكبير في هذا المجال ومحاولة العلماء للوصول إلى اختبار على درجة عالية من الحساسية والنوعية هو السبب وراء الميزات التي يتمتع بها هذا الفحص، ومن أهم إيجابيات فحص الPCR ما يأتي:^[٩]

• البساطة والسرعة في الوصول إلى النتيجة، إذ يمكن من خلال هذا الفحص الحصول على كمية كبيرة من المادة الوراثية الجاهزة للدراسة في غضون ساعة، والتي كانت تحتاج لأضعاف هذا الوقت باستخدام اختبارات سابقة قديمة.
• يحتاج هذا الفحص إلى كمية قليلة من الحمض النووي حتى يُعطي النتائج، إذ يكفي وجود نسخة واحدة من DNA، بشرط كونه كاملًا وغير تالفًا، وهو بذلك يكون قادرًا على دراسة كل جزء من هذا الحبل.
• يستطيع هذا الفحص كشف كل الطفرات الجديدة التي تطرأ على فيروسنقص المناعة المكتسبة، والمعلوم عن الفيروسات هو قدرتها على تشكيل أنماط مستضدية جديدة بين الفترة والأخرى، وبالتالي لا يشكّل التطور المستمر للفيروس أي عبء في التشخيص.
• يقوم هذا الفحص بتضخيم الجزء المُستَهدَف من الحمض النووي دون غيره، وبالتالي يمتلك دقةً عاليةً تجاه الهدف.
• تمكّن هذا الفحص من التخلص من الإيجابية والسلبية الكاذبتَين المتعلقتَين بفيروس نقص المناعة المكتسب.

سلبيات فحص ال PCR

على الرغم من قدرة فحص تفاعل سلسلة البوليميراز على اكتشاف العديد من الطفرات، وتأكيد الإصابة بالأمراض الفيروسية إلّا أنّه يمتلك العديد من السلبيات والتي غالبًا ما تتعلق بخطوات التحضير لإجراء هذا الفحص، والتي تحتاج لدقة متناهية في الإنجاز، ويمكن وصف السلبيات وفق ما يأتي:^[٩]

• يعمل فحص الPCR في ظروف خاصة جدًا، كما أنّه يحتاج لطول معين من تسلسل الحمض النووي المُستَهدف ال DNA، فمثلًا إذا تم الحصول على تسلسل طويل جدًا، كان من الصعب التأكد من أنّ جميع المعلومات قد تم نقلها بشكل دقيق، وبالتالي قد يتم تجاوز مناطق من التسلسل تحتاج لدراسة فعلية.
• إذا ظهر البادئ لأكثر من مرة في تسلسل ال DNA، فقد يؤدي ذلك لوجود هذا البادئ في أكثر من مكان، مما يؤدي لوجود عدة نسخ متشابهة من هذا الحمض النووي، أو وجود نسخة خاطئة قد تعطي نتائج سلبية خاطئة.

تكلفة فحص ال PCR

ساعد اكتشاف فحص تفاعل سلسلة البوليميراز في اكتشاف عدة أنواع من الفيروسات حتى هذا الوقت، ما جعل هذا الفحص مميزًا عن بقية الاختبارات التي تم استخدامها لمئات السنين، ومن أشهر الفيروسات التي تم اكتشافها وإثبات الإصابة بها هو فيروس عوز المناعة المكتسبة، وفيروس التهاب الكبد C، كما تم تحديد أنواع الفيروسات التي تصيب النباتات^[١٠]، وقد اختلفت تكلفة هذا الفحص بحسب السبب المطلوب له، إذ كانت تتراوح قيمة التكلفة ما بين 15 إلى 30 دولار، ويمكن وضع هذه التكلفة ضمن هذه المجموعات:^[١١]

• تكلفة 15 دولار: هذه التكلفة تتواجد في فحص كشف عن الكلاميديا أو ما يُعرَف بالمتدثرة، والتي غالبًا ما تتواجد في الكبد أو المشيمة، كما تتواجد هذه التكلفة في فحص الكشف عن المفطورات الرئوية وتفريقها عن بقية أنواع المفطورات، والكشف عن السالمونيلا.
• تكلفة 25 دولار: تقدر تكلفة تشخيص الإصابة بفيروس الإنفلونزا بمختلف أشكاله بحوالي 25 دولار.
• تكلفة 30 دولار: تتواجد هذه القيمة في فحص الكشف عن بكتيريا المطثيات، والإيشريشيا الكولونية.

المراجع

1. ^ ^{أ ب} "What is PCR (polymerase chain reaction)?", www.yourgenome.org, Retrieved 2020-05-26. Edited.
2. ^ ^{أ ب ت ث ج} "Polymerase chain reaction", www.britannica.com, Retrieved 2020-05-26. Edited.
3. ↑ "Polymerase Chain Reaction", www.sciencedirect.com, Retrieved 2020-05-26. Edited.
4. ↑ "Polymerase Chain Reaction (PCR) for HIV ", stanfordhealthcare.org, Retrieved 2020-05-28. Edited.
5. ↑ "POLYMERASE CHAIN REACTION AND ADVANCES IN INFECTIOUS DISEASE DIAGNOSIS", www.ncbi.nlm.nih.gov, Retrieved 2020-05-20. Edited.
6. ↑ "Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction", www.sciencedirect.com, Retrieved 2020-05-26. Edited.
7. ↑ "CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel ", www.fda.gov, Retrieved 2020-05-26. Edited.
8. ↑ "Specificity, Efficiency, and Fidelity of PCR", genome.cshlp.org, Retrieved 2020-05-20. Edited.
9. ^ ^{أ ب} "How the Polymerase Chain Reaction is used in Medicinal Science and the Diagnosis of HIV", flax.nzdl.org, Retrieved 2020-05-26. Edited.
10. ↑ "Virus Characterization", www.sciencedirect.com, Retrieved 2020-05-31. Edited.
11. ↑ "New PCR Tests at ADDL", www.addl.purdue.edu, Retrieved 2020-05-26. Edited.